? ? ? ?來源：follow皮皮熊? ?藥界小學(xué)生 ? ? ? ?實(shí)體瘤治療的三座高山“免疫抑制，T細(xì)胞浸潤和抗體滲透”。每個(gè)點(diǎn)都有不同的解決方案，比如檢查點(diǎn)抑制劑，IDO抑制劑，TGFβ抑制劑等等。這其中通過CD3雙抗銜接T細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞是最早也是最直接的解決T細(xì)胞浸潤的手段。然而和CART治療實(shí)體瘤類似，T細(xì)胞的功能是如此的強(qiáng)大（CD3×CD19在0.015mg/m2/day就可以PR或CR），以至于on-target off-tumor的毒性很多時(shí)候是致命的。在優(yōu)質(zhì)靶點(diǎn)嚴(yán)重缺失的今天，Genentech 通過親和力改造降低Her2×CD3雙抗與正常組織的結(jié)合能力，降低毒性，相關(guān)結(jié)果于近日發(fā)表在Science Translational Medicine上。 ? ? ? ?在之前的研究中Genentech制備了HER2×CD3高親和力雙抗4D5，體內(nèi)外結(jié)果顯示4D5除了可以有效的殺傷HER2高表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞，還會(huì)和正常組織上的HER2進(jìn)行結(jié)合。而本研究的目的就是希望增加4D5的選擇性，降低和正常組織上HER2的結(jié)合，提高治療窗。通過突變4D5序列，獲得親和力在0.3-353nM范圍內(nèi)的8種抗體，體外殺傷實(shí)驗(yàn)顯示當(dāng)親和力低于49nM時(shí)雙抗幾乎不能對(duì)乳腺癌細(xì)胞產(chǎn)生殺傷活性，這和抗體ADCC效應(yīng)依賴于親和力大小相一致。 ? ? ? ?之前有Zymeworks設(shè)計(jì)HER2×HER2雙抗（ZW25），提高親和力，有利于結(jié)合低表達(dá)乳腺癌細(xì)胞表面的HER2。出于類似的想法，Genentech設(shè)想通過串聯(lián)兩個(gè)低親和力HER2 Fab來提高HER2×CD3雙抗的活性。除此之外，親和力是一個(gè)相對(duì)值，這個(gè)值依賴于受體或抗原的密度，因此Genentech使用不同HER2密度的SK-BR-3和MCF-7細(xì)胞（HER2密度SKBR3約為MCF7的100倍）對(duì)比了改造后雙抗的結(jié)合能力以及殺傷活性。結(jié)果顯示，在SKBR3細(xì)胞上4D5-H91A結(jié)合能力和4D5相當(dāng)，殺傷活性也相當(dāng)，說明通過串聯(lián)低親和力的Fab可以恢復(fù)其功能，而在MCF7細(xì)胞上，由于HER2密度低，4D5-H91A結(jié)合能力和殺傷能力要遠(yuǎn)低于4D5。同時(shí)Genentech也指出49nM是串聯(lián)HER2 Fab的最小親和力，更低親和力的Fab串聯(lián)后并不能恢復(fù)其活性。 ? ? ? ?那造成這樣的原因是什么？4D5和4D5-H91A蛋白水平親和力相差超過150倍。但SKBR3細(xì)胞水平的結(jié)合能力是差不多的，無論是直接結(jié)合實(shí)驗(yàn)還是競爭結(jié)合實(shí)驗(yàn)，并且表觀結(jié)合能力比Biacore結(jié)果提高10倍。這一結(jié)果也直觀解釋了串聯(lián)兩個(gè)Fab可以提高細(xì)胞水平的結(jié)合能力。然而對(duì)于低HER2拷貝的MCF7細(xì)胞，其直接結(jié)合的KD值要大于100nM，表明當(dāng)細(xì)胞表面HER2密度較低時(shí)，這種低親和力Fab串聯(lián)結(jié)構(gòu)并不能有效的結(jié)合。 ? ? ? ?梯度濃度殺傷實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在SKBR3細(xì)胞中4D5-H91A的殺傷能力和4D5幾乎一樣，而在MCF7細(xì)胞中直到10ug/mL依然沒有體現(xiàn)出殺傷活性。隨后Genentech根據(jù)HER2的mRNA水平，分別在高，中，低三種HER2表達(dá)水平的腫瘤細(xì)胞中考察了4D5-H91A和4D5的殺傷活性，在50ng/mL時(shí)4D5可以有效殺傷低HER2細(xì)胞，而在50ug/mL時(shí)4D5-H91A依然對(duì)低HER2細(xì)胞沒有明顯的殺傷效果，從這個(gè)角度講4D5-H91A的選擇性提高了有1000倍。 ? ? ? ?流式測定細(xì)胞表面HER2受體的數(shù)目，建立受體數(shù)目和殺傷活性的關(guān)系，結(jié)果顯示當(dāng)每個(gè)細(xì)胞表面HER2數(shù)目低于20萬個(gè)時(shí)4D5-H91A對(duì)其不敏感，而當(dāng)HER2數(shù)目高于20萬個(gè)時(shí)4D5-H91A對(duì)其敏感。 ? ? ? ?分別在高低HER2移植瘤模型中評(píng)價(jià)4D5和4D5-H91A的體內(nèi)活性。結(jié)果顯示在HER2高表的KPL4模型中4D5和4D5-H91A單劑量均可有效抑制腫瘤生長，其中4D5活性要優(yōu)于4D5-H91A（10倍，0.5mpk VS 0.05mpk）。但是在HER2低表達(dá)的HT55模型中，4D5在0.1mpk時(shí)可以誘導(dǎo)腫瘤緩解，而4D5-H91A即便在50mpk時(shí)也沒有任何的抗腫瘤活性。從這個(gè)角度來講，4D5-H91A的體內(nèi)選擇性至少提高了100倍。 ? ? ? ?通過Fc改造降低與FcR的親和力后4D5-H91A即便在高濃度下也不都單獨(dú)激活T細(xì)胞或者NK細(xì)胞。在猴MTD實(shí)驗(yàn)中，20mpk并未觀察到任何異常和毒副反應(yīng)，伴隨TK血樣中的4D5-H91A在體外依然具有殺傷活性。這些結(jié)果表明猴正常組織中低表達(dá)的HER2并不會(huì)引發(fā)4D5-H91A介導(dǎo)的T細(xì)胞的殺傷活性。 ? ? ? ?常言單抗看靶點(diǎn)，雙抗看平臺(tái)，雙抗的設(shè)計(jì)與最終雙抗的成敗有巨大的關(guān)系，在前面的文章中介紹過Genentech的這種非對(duì)稱型雙抗結(jié)構(gòu)，今天Genentech在這種結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上通過親和力的改造大大提高了HER2×CD3雙抗的選擇性。這種思路無論對(duì)于雙抗還是CART都很有啟發(fā)性，希望這樣的研究越來越多，通過技術(shù)的創(chuàng)新改變靶點(diǎn)的先天缺陷，比如CD47，有可能嗎？ ? ? ? ?如涉及知識(shí)產(chǎn)權(quán)請(qǐng)與我司聯(lián)系
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