技術分享 | 基于IgG1的雙特異性抗體的設計、表達和純化 |
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2020-06-15 |
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來源：生物制品圈
摘要：雙特異性抗體（BisAbs）由于具有兩個不同的抗原結合位點，可以同時靶向兩種受體從而為癌癥和炎癥等復雜疾病提供可能的治療方法，目前已經成為極具研發前景的新型藥物候選物。本文基于全長IgG-scFv形式的BisAbs，提供了下圖所示臨床前研究包含的從分子設計，重組表達到下游純化的方法概述，并討論了優化瞬時表達和純化需要實際考慮的因素和策略。
?????? 1.?雙特異性抗體概述
?????? BisAbs由兩個不同抗原結合位點組成一個抗體分子，與結合單個靶標的抗體相比，BisAbs具有幾個優點：
?????? (1)?通過兩個靶標結合在不同細胞上，BisAbs可以將特定的免疫細胞（如T細胞和NK細胞）重定向到腫瘤細胞，以增強腫瘤殺傷力；
?????? (2) BisAbs可以同時阻斷兩種不同介質在癌癥和炎癥等復雜疾病的進展中的作用；
?????? (3) BisAbs由于與兩個不同的細胞表面靶標相互作用而增加了結合特異性；
?????? (4) BisAbs促進受體聚集，從而促進靶標內化和降解。
過去二十年中，分子工程學的進步導致了一系列具有不同結構和分子量的重組BisAb的開發，目前已經有兩種基于IgG的BisAb（catumaxomab和emicizumab-kxwh）和一種片段BisAb（blinatumomab）獲批上市，以及處于不同臨床階段的50多種候選藥物。BisAb可以分為兩類，即具有和不具有抗體Fc區的BisAb，前者即IgG樣BisAb由于具有Fc區，因此有助于其純化，溶解性和穩定性，并提供額外功能，例如抗體依賴的細胞毒性，補體依賴的細胞毒性，FcRn介導的延長半衰期以及藥物結合框架。本文所述BisAbs基于全長IgG1抗體支架和單鏈可變區（scFv）。
?????? 1.1?IgG1的結構特征
?????? 如Fig. 2所示，IgG1分子由四個多肽鏈，即兩個相同的重鏈（HC）和兩個相同的輕鏈（LC）組成。HC由一個可變域（VH）和三個恒定域（CH1，CH2和CH3）組成。每個LC包含一個可變域（VL）和一個恒定域（CL）。VH和VL?域各自具有三個互補決定高變區定義抗體的特異性。VH-CH1結構域與VL-CL?結構域相互作用形成抗原結合片段（Fab），每個IgG1分子都包含兩個抗原結合位點，其Fc結構域提供效應子功能并延長了半衰期。
?????? 1.2?ScFv的結構特征
?????? 在IgG1的模塊化抗體片段中，scFv是產生功能性單價抗原結合片段的最常用的方式。ScFv由抗體的VH和VL?結構域組成，其中第一個可變域的C末端通過柔性肽linker與第二個結構域的N末端連接（Fig. 3A），包括VL-linker-VH或VH-linker-VL兩種連接方式（Fig.?3B）。由于兩個可變域的分子間配對混雜，并且VH和VL?結構域之間非共價相互作用的親和力和特異性相對較低，所以scFv重組生產可能會導致單體，二聚體和高階多聚體混合物的出現。這些寡聚混合物的形成受linker的長度和組成的影響，Fig.?3B所示linker中，(GGGGS)3使最廣泛，但是(GGGGS)4可以最小化上述聚集體的形成。此外，將VH?44和VL?100位點突變為半胱氨酸以形成兩個域之間的鏈間二硫鍵，也是減少寡聚和提高scFv穩定性的一種廣泛使用的策略（Fig. 3?C，D）。
?????? 2. IgG1-scFv BisAbs的設計
?????? 本文描述的IgG1-scFv BisAbs如Fig. 2中所示，Fig.?4顯示了用于工程化IgG1-scFv的設計示意圖，具體設計策略如下：
?????? 2.1?ScFv設計策略
?????? 所有scFv均選擇VL-VH方向，用(GGGGS)4?linker將VL與VH連接，并將VH?44和VL?100位點突變為半胱氨酸形成鏈間二硫鍵，以減少寡聚并提高scFv穩定性（Fig. 3）。
?????? 2.2?IgG1與scFv的連接策略
?????? 提供Fig. 2所示的4種可行性連接策略，具體方案如Fig. 3所示。
?????? 在Bis1Ab中，scFv使用(GGGGS)2?linker連接到LC的N端，原始HC維持不變；在Bis2Ab中，scFv使用(GGGGS)2?linker連接到HC的N端，原始LC維持不變；在Bis3Ab中，scFv?使用(GGGGS)2?linker連接到CH3域的C末端，原始LC維持不變；在Bis4Ab中，scFv使用(GGGGS)2?linker插入到位置220后的鉸鏈域，以連接scFv的N端和C端，原始LC維持不變，輕鏈和重鏈之間以及鉸鏈之間的天然鏈間二硫鍵維持不變。
?????? 上述幾種BisAbs已用于多種治療環境。例如，基于Bis2Ab的MEDI4276（由MedImmune開發，I期臨床）作為成人晚期乳腺癌或胃癌的二線治療藥物；基于Bis3Ab的MM-141（由Merrimack開發，II期臨床失?。┯糜谥委熮D移性胰腺癌；基于Bis4Ab的MEDI3902（由MedImmune開發,?II期臨床）用于預防接受重癥監護的成年患者出現的呼吸機相關性肺炎。
?????? 3.?IgG1-scFv BisAbs的重組表達
?????? 3.1?表達載體的設計
?????? 這里描述的BisAb與IgG1類似,都是由等摩爾比的多肽鏈組成的異二聚體。重組表達是通過編碼兩個多肽鏈的單個載體系統實現的，每個多肽鏈都有自己的基因表達盒。使用單載體系統的優點包括：
?????? (1)?僅使用一種載體進行轉染更加簡便；
?????? (2)?基于基因表達盒的系統促進高通量克隆；
?????? (3) LC和HC的基因比例相等，在平衡BisAbs表達的同時最大程度地減少LC產生過量。
?????? BisAb重組表達載體示意圖如Fig. 5所示。具體的，兩條BisAb鏈的表達是由單獨的巨細胞病毒啟動子（PCMV）驅動，BisAb鏈的有效分泌受兩個單獨的信號肽控制，該信號肽介導兩個多肽向內質網的轉運，以進行適當的折疊，組裝和翻譯后修飾。LC多肽信號序列是MDMRVPAQLLGLLLLWLPGPGARC，其是天然人κLC信號肽，HC多肽信號序列是MGWSCIILFLVATATGVHS，其對應于小鼠HC前導序列。載體中包含SV40?多聚核苷酸序列，且存在的獨特限制酶切位點可促進抗體可變區的克隆。
?????? 3.2?優化DNA密碼子實現最佳哺乳動物表達
?????? 用于BisAb抗體骨架的可變域VH和VL以及scFv的序列可以源自公共數據庫，雜交瘤，噬菌體展示，酵母展示和哺乳動物展示。這些DNA序列通常不是最佳的用于在中國倉鼠卵巢（CHO）細胞最大化重組蛋白質表達。
?????? 密碼子會影響基因表達，穩定性和翻譯效率。DNA序列優化包括去除核苷酸重復序列，內部TATA盒，核糖體進入位點以及剪接供體和受體位點；減少富含AT或GC序列延伸；優化tRNA密碼子的使用頻率，以最大化信使RNA的翻譯和穩定性。除了VH，VL以及scFv之外，BisAb的linker序列和恒定域也可以進行密碼子優化。另一個基因設計策略是通過密碼子優化過程來減少LC的表達（因為LC通常比HC過表達）。
?????? 3.3?DNA載體制備
?????? 使用無內毒素質粒DNA純化方法制備BisAb表達載體（例如來自Qiagen的EndoFree質粒試劑盒（#12362））。內毒素是從細菌中提取的質粒DNA中的常見污染物。因此，在生產用于體外和體內研究的BisAb時，必須使用無內毒素的材料和試劑。可以按照手冊使用Charles River Endosafe PTS系統（#PTS100）確定內毒素的存在，小于0.1 EU/mg的質粒DNA被認為不含內毒素。DNA載體制備好后可儲存于-80℃備用。
?????? 3.4?制備用于瞬時表達的哺乳動物細胞
?????? 制備DNA載體后，通過CHO懸浮細胞進行瞬時表達。使用添加有25μM蛋氨酸亞砜亞胺（MSX）和100μg/ mL潮霉素-B（HB）的MedImmune專用培養基培養和維持細胞。在2升一次性聚碳酸酯錐形培養瓶（VWR,?#FPC2000S）使細胞以500 mL的體積生長，將瓶置于37℃，140rpm，?5%CO2環境下的Multitron培養箱（InforsHT）中培養。每3天分裂一次細胞，以確保存活率保持在97%以上，并且細胞密度不超過5×106?/ mL。
?????? 3.5?瞬時轉染表達
?????? 在轉染過程中加入HB和MSX將對細胞活力有害，因此我們將細胞以0.5×106?/mL的濃度在不含HB和MSX的MedImmune培養基中傳代培養?3天，以稀釋CHO懸浮培養時引入的HB和MSX。
?????? 轉染前：轉染前24h，用MedImmune培養基將細胞稀釋至1×106?/mL，以在轉染時獲得濃度約為2×106?/mL的細胞。
?????? 轉染中：對于500 mL轉染，我們向7.5 mL 150 mM無菌氯化鈉溶液中添加了500μg無內毒素的DNA。在另一個無菌試管中，我們向5 mL 150 mM無菌氯化鈉中加入2.5 mL?1 mg/mL聚乙烯亞胺（PEI,?#24756-1）。然后將DNA和PEI溶液合并，并在室溫下孵育1?min，隨后將DNA/PEI混合物添加到細胞中，并持續至少4 h的培養過程。此后，向轉染細胞中加入3.3%（v/v）的MedImmune原料A和0.2%（v/v）的MedImmune原料B，并轉移至34°C的培養箱進行瞬時表達。
?????? 轉染后：在轉染后3，7，10和14天確定細胞活力和表達水平，瞬時表達在轉染后14天或當細胞活力降至70%以下時終止。
?????? 3.6?細胞活力的測定
?????? 使用Visell XR細胞活力分析儀（Beckman Coulter）測定細胞活力和密度。該系統設置為使用一次抽吸循環混合3次，并收集30張最小直徑為5μm，最大直徑為10μm的圖像。亮度設置為85%，清晰度設置為100，活細胞斑點亮度設置為65%，活細胞斑點面積設置為5%，減聚度為中等。這些設置對于我們在瞬時表達方案中使用的CHO細胞是最佳的。
?????? 3.7?瞬時表達后的CHO收獲
?????? 轉染后十四天或當細胞活力降至70%以下時，使用Beckman Coulter Allegra X 15R臺式離心機在室溫下離心（1000?g）?20?min收集CHO細胞。丟棄細胞并通過0.22 μm真空過濾裝置（VWR，#97066-204）過濾培養基。過濾后的培養基可以在4°C或-80°C下存儲，解凍后建議重新過濾存儲的培養基。
?????? 3.8?BisAb的定量
?????? 使用下述方法來量化細胞培養期間以及收獲和過濾后得到的BisAb。該定量方法基于將BisAb結合至與Agilent 1200高效液相色譜（HLPC）連接的蛋白A柱（POROS A，20μM，4.6×100 mm，1.7 mL，Thermo Fisher Scientific#2502226?）上。
?????? BisAb檢測：通過0.2μm離心過濾器（VWR，#82031-356）過濾培養基（150 μL）。然后將過濾的培養基（100 μL）注入HPLC蛋白A系統，并執行以下步驟：100%流動相?A（0.5min），100%流動相??B（1.5?min），100%流動相A（2?min）。在室溫下以3.5mL/min進行色譜操作，并于280 nm吸光度下檢測BisAb。其中，結合流動相A為1×PBS，pH 7.2（Thermo Fisher Scientific，#20012-027），洗脫流動相B為含有0.1％磷酸（v/v）的1x PBS pH 1.8。
?????? 標準曲線制作：按照上述相同的方法制作標準曲線（Fig. 6A）。使用15.6至2000μg（15.6，31.25，62.5，125，500，1000和2000μg）范圍的99%單體IgG1制作標準曲線，并繪制樣品濃度與每種洗脫標準品在280 nm處洗脫曲線（Fig.6?B）下面積的關系，然后通過將曲線下的面積乘以標準曲線的斜率的倒數來計算BisAb的濃度。Fig.7為轉染10天后4種特異性BisAb的瞬時表達數據（于第14天終止）。
?????? 4.?IgG1-scFv BisAbs的純化和評估
?????? 4.1?從培養基中純化BisAb
?????? BisAb的純化使用蛋白A?親和色譜法進行，該方法通常用于純化具有完整Fc區的IgG1和BisAb。此處提供的方法使用500 mL培養基和1個5 mL MabSelect?Agarose Fast Flow（GE Health Life Sciences, #28-4082-55，載量為30 mg/mL），可以根據起始培養液的體積和預期規模進行適當縮小或放大。
?????? 準備工作與介質平衡：將色譜柱連接到AKTA Pure系統（GE Health Life Sciences），在室溫下于5mL/min流速，280nm波長監控下進行純化。首先用10倍柱體積（CV）的無菌水處理該柱，以去除20%乙醇存儲溶液，然后用10 CV無內毒素的1x PBS，pH 7.4（結合緩沖液）平衡介質。
?????? BisAb吸附：將過濾后的澄清上清液加載到色譜柱，然后用結合緩沖液沖洗10 CV以洗去未結合的雜質污染物，各組分收集后保存在4°C以便進行后續分析（如果需要）。
?????? BisAb洗脫：使用0.1 M甘氨酸-HCl，pH 2.2?洗脫親和捕獲的BisAb。在預裝有50μL 1.0 M Tris-HCl，pH 7.0且不含內毒素的1.5 mL?Eppendorf管中收集500μL洗脫組分。洗脫組分可在4°C下最多保存3天，然而這種儲存有可能導致抗體聚集。
?????? 抗體聚集是低pH條件下從蛋白A色譜中洗脫BisAb經常遇到的挑戰。為了使聚集最小化并提高產量，我們經常采用洗脫優化方法，例如使用3.2的pH值，并向洗脫緩沖液中添加0.1 M的精氨酸，這已被證明可以防止抗體聚集。洗脫后進行色譜柱再生，即將蛋白A柱用5 CV的0.1 M甘氨酸-HCl（pH 2.2），10 CV的結合緩沖液，10 CV的超純水和10 CV的20%（v/v）乙醇洗滌。
? ? ?? 4.2?BisAb濃度測定
?????? 使用Thermo Fisher Scientific NanoDrop 2000分光光度計在280 nm處測定吸光度，再根據理論消光系數確定上述洗脫組分中的BisAb濃度。
??? ?? 4.3?BisAb單體含量測定
?????? 通過尺寸排阻高效色譜分析（SEC-HPLC）測定上述洗脫組分中的BisAb單體含量。使用配備自動進樣器，高壓梯度溶劑輸送泵，色譜柱室和二極管陣列檢測器（在280 nm波長檢測）的Agilent 1260系列HPLC系統，以及Tosoh Bioscience的TSKgel G3000SWxl SEC色譜柱（300×7.8 mm，250?，粒徑5 μm）。
?????? 室溫下的運行條件包括流速1 mL/min；運行時間20min；流動相100 mM磷酸鈉和100 mM硫酸鈉，pH 6.8。每次分析使用100μg?BisAb。蛋白質A純化和陶瓷羥基磷灰石層析（CHT）純化（用于去除聚集體）后BisAb的典型SEC-HPLC色譜圖如Fig.?8?A, C所示。由于疏水性增加，某些BisAb可能在SEC凝膠基質上發生非特異性吸附，從而導致保留時間偏移和較差的峰分辨率。我們發現向流動相中添加10%異丙醇（v/v）（Sigma Aldrich，#I95516）可以減少非特異性吸附，從而提高色譜分辨率。
?????? 4.4?去除聚集體和其他雜質
?????? CHT被廣泛用于從聚集體和其他蛋白A純化后的雜質中純化單體抗體和BisAb?。抗體或BisAb與CHT樹脂之間存在多種相互作用方式，主要方式是抗體或BisAb表面胺與CHT樹脂磷酸基團之間的陽離子交換，以及CHT樹脂鈣位點于抗體或BisAb羧基之間的金屬螯合。
?????? 準備工作：我們使用預裝的II型CHT樹脂（BioRad，E732-4334；載量為15–25 mg/mL）和磷酸鹽緩沖液的線性梯度溶液作為流動相進行洗脫。使用AKTA Pure系統（GE Health Sciences）在室溫下以5 mL/min和280 nm的吸光度進行純化。流動相A為pH 7.0的10 mM磷酸鈉，流動相B為pH 7.0的含2 M NaCl的10 mM磷酸鈉。
?????? 純化過程：將上述蛋白A色譜洗脫下的BisAb上樣到預先平衡過的CHT柱上，然后用5 CV流動相A洗去雜質。然后通過在25 CV內線性梯度切換至100%流動相B對BisAb進行洗脫。BisAb的典型CHT色譜圖如Fig.8B所示，包括聚集體在內的雜質在單體之前被洗脫。收集每個主峰的1 mL餾分，然后使用SEC-HPLC分析其單體含量?？梢钥吹剑褂肅HT純化后BisAb單體含量為97%（Fig.?8C），在CHT之前該數值為70%（Fig.8?A）。隨后按照手冊對CHT色譜柱進行再生，并保存在0.1 N NaOH中。
?????? 4.5?制劑
?????? CHT后，將合并的單體BisAb餾分使用0.22-μm注射器過濾器（VWR，#28144-040）進行過濾，并在25 mM組氨酸-HCl，7%蔗糖，pH 6.0中于4°C下透析過夜。透析后將BisAbs用0.22-μm注射器式過濾器重新過濾，然后使用Mustang E注射器式過濾器（VWR，#28140-521）過濾，以去除潛在的內毒素污染。加入聚山梨酯-80至終濃度為0.02%（v/v）。確認單體含量，并且制備等分的BisAb，如果其單體含量>97%，則將其保存在-80°C中。
?????? 5.?結論
?????? BisAb在癌癥免疫治療中具有廣泛的應用潛力，它們可以以更加特異性的方式重定向效應細胞，改善組織選擇性并將細胞毒性有效載荷遞送至靶點。本文全面描述了BisAbs的設計，表達以及純化的方法。
?????? 由于本文的BisAbs中存在Fc區，因此此處的設計，表達和純化方法可以推廣應用到IgG樣BisAb的工藝開發中。但是，BisAb開發中的一些挑戰仍然需要改進，例如優化純化過程和回收率以確保穩健，穩定和可放大的BisAb生產工藝過程等。本文提供的方法用于在臨床前研究中使用CHO細胞制備大量BisAb（7周內即可完成）。所需試劑和材料大部分在市場可以買到，但表達載體，細胞培養基和細胞培養原料來自MedImmune，因此當使用可商購的抗體表達載體和培養基時，可以對策略和方法進行適當調整和優化。
?????? 如涉及知識產權請與我司聯系
參考來源：
Dimasi N, Fleming R, Wu H, et al. Molecular engineering strategies and methods for the expression and purification of IgG1-based bispecific bivalent antibodies[J]. Methods, 2019: 77-86.
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