專家點評 | 3篇Nature1篇Nat Immuno揭示調控耗竭CD8+T細胞的關鍵因子 |
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2020-06-15 |
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?????? 來源：小飛飛?BioArt
?????? 急性感染中，CD8+初始T細胞在接受抗原刺激之后，可分化為CD8+效應T細胞（effector CD8+ T cells, TEFF）。如果抗原被清除，一部分的TEFF會持續(xù)存在，形成長壽的可以自我更新的記憶T細胞（memory CD8+ T cells,?TMEM），以對再次感染產生快速的免疫反應。相反，在慢性感染或者腫瘤中，抗原持續(xù)存在，初始T細胞的分化將會變得不一樣，T細胞會分化為耗竭T細胞（exhausted CD8+ T?cells,?TEX）【1】。TEX可限制部分病原體感染或者腫瘤免疫反應，來限制免疫介導的病理損傷，但這種限制性功能的結果往往是疾病的持續(xù)進展或惡化【2】。在小鼠和人的許多慢性感染和腫瘤中，T細胞耗竭是一個比較普遍的特征。TEX也成為腫瘤免疫檢查點抑制治療中的一個主要靶標。
?????? TEX的特征包括，炎癥細胞因子（IL-2,TNF,IFNγ）產生減少，表達較高水平的抑制性受體（PD-1,LAG3,TIGIT等），代謝的改變，受損的擴增和存活能力等【1】。同時TEX也表現(xiàn)出不同的轉錄水平的變化，對幾種關鍵轉錄因子的使用都和效應T細胞有明顯區(qū)別。此外，文獻報道與TEFF和TMEM相比，TEX有大約6000個不同的染色質開放區(qū)域【3】。可見，TEX不僅僅是TEFF或者是TMEM的一種狀態(tài)，而是一類不同的細胞亞群。但是，起始TEX分化發(fā)育以及其表觀遺傳水平和轉錄水平變化的具體機制還有待研究。
?????? 胸腺細胞選擇相關HMG盒蛋白（Thymocyte selection-associated HMG box protein,TOX）是細胞核DNA結合蛋白，也是HMG盒蛋白超家族（high-motility group box superfamily）成員之一，以結構依賴而非序列依賴的方式與核DNA結合【4】。已有文獻可知，TOX對胸腺CD4+T細胞發(fā)育，NK細胞發(fā)育以及固有淋巴細胞發(fā)育都有重要作用【5】。但是其在慢性感染或腫瘤中耗竭CD8+T細胞中的作用還未知。
?????? 2019年6月17日，Nature以及Nature?Immunology雜志同時發(fā)表四篇相關文章，講述了TOX對CD8+耗竭T細胞分化發(fā)育的重要作用及其分子機制。BioArt現(xiàn)整理如下，并特別邀請了從事相關工作的權威專家、清華大學免疫所董晨教授進行了點評。
?????? 第一篇是來自Department of Systems Pharmacology and Translational Therapeutics, Philadelphia, PA, USA的E. John Wherry團隊在Nature上發(fā)表的題為TOX transcriptionally and epigenetically programs CD8+ T cell exhaustion的Article形式長文文章，發(fā)現(xiàn)慢性感染中，TOX對TEX的分化形成至關重要，可以從轉錄水平和表觀遺傳水平上啟動并主導TEX的分化發(fā)育，并對其中的具體機制做了研究。
?????? 首先研究人員利用LCMV急性感染（Armstrong; Arm）和慢性感染模型（Clone 13; Cl-13），分析感染以后病毒特異性CD8+T細胞（TEFF，TMEM和TEX）轉錄水平數據的差異，發(fā)現(xiàn)感染6天以后，TEFF，TMEM和TEX基因表達有較大的差異，其中Tox是差異表達最大的基因。同時ATAC-Seq測序表明，與TEFF相比，TEX中Tox?基因座染色質開放性(chromatin accessibility)增加。這些數據表明TOX或可在TEX分化中起重要調控作用。
?????? 隨后研究人員發(fā)現(xiàn)，Cl-13感染之后4天開始，TOX蛋白表達量就明顯增加，感染后5天80%?LCMV特異性P14 CD8+ T?細胞有較高水平TOX表達，且這種高表達可持續(xù)200天以上。與之相反的是，在急性感染中，盡管TOX在TEFF反應起始有表達，感染5-6天后達到高峰，但只有低于25%TEFF有TOX表達，且表達量相對較低，感染8-15天之后，表達量降低到基線水平。在Cl-13感染中TOX表達與T細胞耗竭相關轉錄因子TCF1和Eomes表達正相關，同時TOX+細胞也高表達抑制性受體PD-1, TIGIT, LAG3, 和?CD160等。由此可見，高水平持續(xù)性TOX的表達和T細胞耗竭密切相關。
?????? 為進一步研究TOX在TEX中作用，研究人員利用TOX Flox/Flox?CD4Cre P14小鼠在P14T細胞中敲除TOX。慢性感染中，與WT?P14T細胞的持續(xù)存在相比，TOX敲除P14T細胞在起始階段可產生反應，但隨后數量大幅減少，且不能持續(xù)到感染后15天。但在急性Arm?LCMV感染中，TOX敲除P14T細胞可以產生正常的反應，發(fā)育成為TEFF和TMEM。因此TOX敲除的初始T細胞并不是影響CD8+T效應和記憶細胞的分化，而是導致TEX特異性的缺失。慢性感染中，TOX敲除細胞表達更低水平的PD-1, CD160, LAG3, 和TIGIT，相反2B4和TIM3表達增高，這也與之前文獻報道在Cl-13感染中，PD-1和TIM3表達呈負相關相一致。TOX缺失也提高了T細胞的功能，研究人員發(fā)現(xiàn)與WT相比，TOX缺失腫瘤特異性T細胞對腫瘤具有更強的抗腫瘤能力。TEX的產生和穩(wěn)定需要TCF1，T-bet和Eomes不同轉錄因子在各個發(fā)育階段的作用。TOX的缺失使Eomes表達減少，但不影響T-bet的表達。慢性感染中，TOX缺失使得TEX中TCF1表達幾乎完全消失。但在急性感染中，TOX缺失不影響TCF1在初始T細胞和TMEM中的表達。對Cl-13慢性感染第8天WT和TOX敲除P14T細胞進行轉錄水平測序分析發(fā)現(xiàn)，TOX的缺失，會上調許多TEFF樣基因（Klrg1, Gzma, Gzmb, Cx3cr1, Zeb2?和?Prf1等）而下調Pdcd1?和Cd160?以及其他和TEX祖細胞相關的基因如Myb, Il7r, Cxcr5, Slamf6, Lef1,?和?Tcf7等。總之這些數據表明，慢性感染中，TOX通過促進耗竭相關基因表達抑制效應細胞相關基因的表達從而促進TEX的產生。
?????? 隨后研究團隊通過體外實驗發(fā)現(xiàn)TOX在CD8+T細胞上的表達主要受到鈣調神經磷酸酶（calcineurin）介導的信號調控，而calcineurin信號通路主要由NFAT蛋白家族的介導，Nfatc1 (NFAT2)在TEX中的表達和在TEFF和TMEM中的不同，因此研究人員關注NFAT2。NFAT2敲除P14T細胞在Cl-13慢性感染中，不能表達TOX，與TOX敲除P14T細胞表型類似，NFAT2缺失T細胞不能產生TEX前體細胞，相反產生KLRG1表達升高，PD-1和TCF1表達降低的TEFF樣細胞。Cl-13慢性感染后3-7天，使用calcineurin抑制劑FK506也可產生NFAT2敲除類似結果。在NFAT2敲除P14T細胞中利用逆轉錄病毒過表達TOX可以恢復PD-1和其他抑制性受體的表達，增加Eomes和TCF-1的表達。可見，此感染階段，calcineurin和NFAT2對于TOX的誘導是必須的，且TOX是calcineurin和NFAT2重要下游分子。但慢性感染25-29天之后，使用FK506抑制NFAT2信號，不會影響TOX的表達以及下游PD-1和Eomes的表達。這表明，盡管TOX的起始誘導表達需要NFAT2，但在起始表達建立之后，TOX的表達和TOX依賴的TEX分化卻不依賴于calcineurin信號。
?????? 之后，研究人員檢測TOX是否是誘導T細胞耗竭的充分條件，將逆轉錄病毒過表達TOX的P14T細胞輸入到LCMV Arm感染小鼠中，流式檢測以及RNA-Seq測序都表明TOX過表達使得T細胞向TEX方向分化而阻止其向TEFF和TMEM發(fā)育。
?????? 隨后研究人員分析TOX對TEX表觀遺傳水平的影響。對LCMV Cl-13感染第8天P14T細胞ATAC-Seq發(fā)現(xiàn)TOX的缺失可以引起基因組約4000個區(qū)域染色質開放性的改變，增加了TEFF相關基因位點的染色質開放性而降低了TEX相關基因的染色質開放性。為進一步探究TOX影響TEX表觀遺傳的機制，研究人員利用免疫共沉淀和質譜分析尋找TOX的結合蛋白。分析發(fā)現(xiàn)參與到組蛋白H4和H3乙酰化修飾的HBO1復合物是TOX的主要結合蛋白，同時也發(fā)現(xiàn)TOX和其他多種染色質重塑蛋白可相互作用。
?????? 總之，本研究發(fā)現(xiàn)TOX是TEX分化發(fā)育的主要調控分子，可以從轉錄水平和表觀遺傳學水平上啟動并主導TEX的分化發(fā)育，且發(fā)現(xiàn)了TEX中TOX上下游調控的具體通路。
?????? 第二篇文章是來自德國Technical University of Munich的Dietmar Zehn及其合作者Robert Thimme，?Benjamin Youngblood團隊在Nature上發(fā)表的題為TOX reinforces the phenotype and longevity of exhausted T cells in chronic viral infection的Letter形式文章。
?????? 與第一篇文章相似，這篇文章在小鼠和人中發(fā)現(xiàn)TOX對于耗竭T細胞的產生具有重要作用。該研究團隊也利用LCMV急性和慢性感染小鼠模型發(fā)現(xiàn)，與TEFF相比，TOX特異性在TEX中高表達，且其表達和PD-1呈正相關。在人慢性丙肝病毒（HCV）感染患者中，也發(fā)現(xiàn)了TOX表達的增高并和PD-1表達相關。為進一步探究TOX和TEX的關系，研究人員在T細胞中條件性敲除Tox?5號外顯子（Tox?），移除了Tox核轉運序列和2/3的DNA結合結構域。
?????? 在LCMV慢性感染中，與WT相比，Tox? T細胞有更低的PD-1表達和更高的的KLRG1表達。對WT 和Tox? LCMV-特異性?CD8+ T細胞進行Next generation sequencing?(NGS)測序，結果也表明TOX調控耗竭相關基因的轉錄表達。通過體內LCMV感染實驗，研究人員發(fā)現(xiàn)TOX的表達可以減緩效應T細胞引起的病理損傷。研究團隊還發(fā)現(xiàn)Tox? P14T細胞在慢性感染中會過早死亡，但在急性感染或者混合感染中，Tox? P14T細胞可產生正常的免疫反應。表觀遺傳學水平上，研究團隊也發(fā)現(xiàn)TOX可以調控耗竭相關程序，從而使細胞處于功能障礙狀態(tài)。總之，本文也證明了慢性感染過程中，TOX對于耗竭T細胞的產生分化都具有重要調控作用。
?????? 第三篇文章是來自Memorial Sloan Kettering Cancer Center 和Weill Cornell Graduate School of Medical Sciences的Mary Philip和Andrea Schietinger團隊在Nature上發(fā)表的題為TOX is a critical regulator of tumour-specific T cell differentiation的Letter形式文章，闡述了TOX在調控腫瘤特異性T細胞（tumor-specific T?cell ,TST）功能障礙方面的重要作用。
?????? 本文發(fā)現(xiàn)，TOX在功能障礙的腫瘤特異性CD8+T細胞中高表達，且TOX的表達需要慢性的TCR刺激和NFAT的激活。在體外效應T細胞中過表達TOX可在轉錄水平上誘導出耗竭相關變化。相反，TST中TOX的缺失，則會使耗竭相關轉錄變化消失，也不會上調抑制性受體的表達。盡管TOX缺失的TST有正常的“非耗竭”免疫表型，但他們仍然處于功能障礙狀態(tài)，這表明在功能障礙TST中，對抑制性受體的調控和效應功能的缺失是不相關聯(lián)的。此外，在腫瘤中，TOX缺失CD8T細胞不能夠正常分化發(fā)育，但在急性感染中，其可以正常產生免疫反應分化為效應細胞和記憶細胞。總之本文表明，在慢性抗原刺激下（腫瘤或慢性感染中）TOX是特異性調控功能障礙T細胞分化的重要分子。
?????? 第四篇文章是來自National Institutes of Health（NIH）的Tuoqi Wu，Pamela L. Schwartzberg以及John J. O’Shea團隊在Nature?Immunology上發(fā)表的題為Single-cell RNA-seq reveals TOX as a key regulator of CD8+ T?cell persistence in chronic infection的文章。
?????? 本文利用單細胞測序技術，檢測急性和慢性LCMV感染中病毒特異性CD8+T細胞群的異質性。測序結果表明，急慢性感染中CD8+T細胞轉錄水平差異在CD8+T細胞反應峰之前就已經出現(xiàn)。盡管兩亞群細胞都表達Tcf7相關基因模組，但慢性感染中的祖細胞樣CD8+T細胞富集表達Tox相關基因模組，從而和記憶前體細胞有較大差異。表觀遺傳學檢測表明，慢性感染中，祖細胞樣CD8+T細胞也具有獨特的表觀遺傳學特征，Tox相關基因具有更高的表觀遺傳活性。此外，LCMV慢性感染中，TOX可以維持病毒特異性CD8+T細胞的長期存活，相反，TOX的缺失會導致祖細胞樣CD8+T細胞亞群的缺失影響抗病毒CD8+T細胞的存活。總之，本文通過單細胞測序和表觀遺傳學檢測表明，慢性病毒感染中，祖細胞樣CD8+T細胞受到和記憶前體細胞不同的轉錄水平和表觀遺傳水平的調控，其中TOX在其中起著重要作用。
?????? 以上研究系統(tǒng)而又詳細地闡述了慢性感染以及腫瘤過程中，TOX對耗竭CD8+T細胞分化發(fā)育的調控及其具體分子機制。這些結果也表明：第一，TOX的表達以及其控制的分子事件可以作為一種標志，能夠幫助我們更準確地檢測評估TEX；第二，這一系列研究發(fā)現(xiàn)了調控耗竭T細胞的關鍵分子TOX，對TOX調控也可改變TEX細胞表型，或可用于未來腫瘤免疫治療；第三，這些數據也表明TEX是和TEFF與TMEM不同的細胞亞群，并為這種分群分化提供了相應的分子機制支持。
專家點評
郭心怡、董晨（清華大學醫(yī)學院、清華大學免疫研究所）
?????? T細胞耗竭是T細胞處于抗原長期刺激下出現(xiàn)細胞因子逐漸喪失、高表達抑制性受體、代謝改變、增殖潛力和生存能力下降等特征的過程。耗竭T細胞是針對癌癥病人的免疫檢查點抑制劑治療的主要靶細胞群。2016年底，Nicholas Haining、Nir Yosef兩課題組合作，與E. John Wherry課題組分別報道了耗竭T細胞區(qū)別于記憶T細胞和效應T細胞的表觀遺傳組特征，指出表觀遺傳的改變對耗竭T細胞狀態(tài)的維持具有重要作用【6,7】。然而在T細胞耗竭過程中參與轉錄組及表觀基因組變化的調控機制并不完全清楚。
?????? 2019年6月17日Nature在線發(fā)表的三篇文章和Nature?Immunology在線發(fā)表的一篇文章共同闡述了TOX基因作為一個關鍵調控因子如何參與在慢性病毒感染和癌癥中的T細胞耗竭過程。這四項研究一致發(fā)現(xiàn)，TOX的高表達與多個抑制性受體的高表達、TCF1的低表達相關；TOX的表達受NFAT正向調控。TOX表達即可誘導CD8+ T細胞呈現(xiàn)出耗竭T細胞的主要特征，且TOX的表達在LCMV、HCV或在一個自發(fā)性肝癌模型的抗原特異耗竭T細胞形成其特殊的轉錄組及表觀遺傳組特征中起到關鍵的調控作用，而與記憶T細胞或效應T細胞的形成過程無關，從而進一步暗示了耗竭T細胞是一類特殊的細胞，而非另兩者的一個特殊激活狀態(tài)。同時該四項研究發(fā)現(xiàn)，TOX的表達對于慢性感染或癌癥模型中的抗原特異CD8+ 耗竭T細胞的存活是必需的。敲除TOX后的T細胞雖然PD1等抑制性受體表達下降、細胞因子增多，呈現(xiàn)出較強的效應功能，然而這些T細胞的數量會在后期大量下降，尤其會導致TCF1+的耗竭前體T細胞亞群缺失。E. John Wherry課題組發(fā)現(xiàn)這些前體細胞的缺失是由于TCF1和Eomes的轉錄調控過程失效導致的。因此，TOX對于T細胞正常功能的發(fā)揮以及耗竭T細胞的存活起到了關鍵作用；暗示當環(huán)境中的抗原無法被清除時，TOX調節(jié)了T細胞介導的病毒控制和免疫反應之間的平衡，防止了T細胞因過度激活而引起的細胞死亡。
?????? 此外，Andrea Schietinger課題組與Mary Philip課題組合作發(fā)現(xiàn)，即使體外重新刺激，TOX高表達的腫瘤特異T細胞也無法產生功能性細胞因子，暗示TOX相關的T細胞耗竭不可被逆轉。他們的研究特別發(fā)現(xiàn)，在一個自發(fā)性肝癌模型的腫瘤特異T細胞中敲除TOX后，細胞雖未上調PD1、LAG3等調抑制性受體但仍處于失能狀態(tài)，暗示在腫瘤特異T細胞失能過程中抑制性受體的表達與細胞效應功能的喪失并不緊密相關。
?????? 值得注意的是，TOX的表達既誘導抑制性受體的高表達，使T細胞進入失去功能的耗竭狀態(tài)，同時又對維持耗竭T細胞在慢性感染或腫瘤中的存活至關重要，因此由TOX調控的T細胞耗竭可能是T細胞處于免疫抑制環(huán)境中的一種適應機制。
?????? 已有研究表明，耗竭T細胞的特殊轉錄組、表觀基因組特征會使其所處的失能狀態(tài)無法被逆轉，從而無法對免疫檢查點抑制劑藥物產生持續(xù)的免疫應答【6】。這四篇文章揭示的TOX相關調控機制可能給臨床上不響應現(xiàn)有免疫檢查點抑制劑藥物病人的治療帶來新的思路，也為過繼細胞轉移療法中的T細胞耗竭以及細胞活性維持問題提供了一定的指導意義。
?????? 如涉及知識產權請與我司聯(lián)系
參考文獻
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