? ? ? ?來源：藥學速覽 ? ? ? ?小分子共價抑制劑(covalent inhibitors)也稱不可逆抑制劑(irreversible inhibitors)：是通過共價鍵與靶蛋白殘基發生不可逆結合，從而發揮其生物學功能的一類抑制劑。一般來說，共價抑制是一個兩步過程（圖1a）。首先，抑制劑可逆地與靶酶結合，從而將小分子中的富含電子的化學彈頭近距離接近酶中的活性殘基。在第二步，抑制劑的兩個反應實體和酶之間發生反應形成共價鍵。常見的共價靶頭有丙烯酰胺、環氧、氯乙酰基以及氧磺酰氟和磺酰氟等等（圖1b），常見的氨基酸活性殘基有半胱氨酸、絲氨酸、酪氨酸、賴氨酸以及精氨酸和谷氨酸等等（參考文獻1）。 ? ? ? ?相對可逆抑制劑來說，共價抑制劑具有較高的生化效率、作用較強并且持久，給藥劑量以及給藥頻率減少、藥效學與藥代動力學分離，藥物被迅速清除也能夠維持效力、能夠預防耐藥性的產生、能夠靶向特定蛋白罕見的、非保守殘基，達到較高的選擇性等特點，但是共價抑制劑存在脫靶導致的副作用。本文將重點介紹蛋白激酶、RAS蛋白以及其它被廣泛研究的靶蛋白相關的共價抑制劑的研究進展，進而闡述設計共價抑制劑的挑戰和建議。 ? ? ? ?最初發現的共價抑制劑是乙酰水楊酸和青霉素。乙酰水楊酸的乙酰基團可以共價連接到COX-1上的絲氨酸進而抑制活性；青霉素中的β-內酰胺可以和轉肽酶中活性位點絲氨酸發生共價結合。近年來共價抑制劑的發展史如圖2所示。（參考文獻2） ▉ 蛋白激酶類的共價抑制劑 ? ? ? ?激酶可以將ATP上的γ-磷酸基團轉移到特定靶分子中的氨基酸殘基上，從而改變蛋白質、酶的構象和活性。到目前為止,已經被發現了518種蛋白激酶，這些蛋白激酶的三維結構具有一定的相似性，都有ATP結合domain，因此可以對非共價抑制劑進行合理的結構優化后引入共價靶頭從而設計高效的共價抑制劑。 表皮生長因子受體(EGFR)的不可逆共價抑制劑 ? ? ? ?EGFR屬于受體酪氨酸激酶家族，通過催化蛋白酪氨酸磷酸化控制信號轉導。表皮生長因子受體(EGFR)是一種細胞表面蛋白，可以結合其天然的配體進而誘導酪氨酸自磷酸化和信號細胞增殖。該基因的特定突變與非小細胞肺癌有關(NSCLC)。最常見的是19外顯子缺失(DE746-A750)和一個單點突變，L858R。這些被稱為“激活突變”，因為它們導致配體非依賴的酪氨酸激酶活性。 ? ? ? ?非正常升高的激酶活性可以被ATP競爭性可逆藥物抑制，如吉非替尼和厄洛替尼可以抑制激酶活性水平(圖3a)。然而，另一個活性位點突變T790M降低了它們的至少50%的功效。近年來報道了一些不可逆抑制劑如PD168393，PF00299804 (dacomitinib)、和EKB569 (pelitinib)(圖3b)均有報道，但并不能成功克服與T790M突變相關的藥物療效問題。Neratinib可以和C797進行共價結合，但由于其生物利用度不高以及腹瀉的副作用而沒有進一步的研究。Afatinib是一種ErbB家族抑制劑劑，是FDA批準的第一個EGFR共價抑制劑。單獨使用阿法替尼延長無進展生存(PFS)時間幾乎是安慰劑聯合治療患者的3倍，當使用西妥昔單抗聯合治療，對L858R / T790M erlotinib-resistant腫瘤也產生不錯的效果，但會引起皮疹和腹瀉的副作用。 ? ? ? ?為了減輕副作用，科學家們設計了三代共價抑制劑，WZ4002可以與C797形成共價連接，且嘧啶環上的氯可以與790位甲硫氨酸形成鹵鍵，這個相互作用增加了化合物對EGFR(T790M)的選擇性。此外2015年11月，FDA批準了由阿斯利康開發的TAGRISSOTM(奧希替尼，原名AZD9291)圖4b)，用來治療晚期NSCLC。臨床前研究表明IC50值為對L858R突變體的活性為12 nM，對L858R/T790M EGFR雙突變體的活性為1 nM，該藥物對EGFR L858R/T790M表現出約200倍的效力。 Bruton’s tyrosine kinase (BTK)的不可逆共價抑制劑 ? ? ? ?布魯頓酪氨酸激酶（Bruton’s tyrosine kinase，BTK）是胞漿內非受體型酪氨酸激酶TEC家族中的一員，在B細胞生長發育、增殖分化過程中起著重要作用，同時也是B細胞惡性腫瘤的治療靶點，BTK突變導致一種免疫缺陷疾病—X-連鎖無丙種球蛋白血癥（X-linked agammaglobulinemia，XLA）。Ibrutinib(原名PCI32765，見圖5a)是一種共價BTK抑制劑，它被批準用于治療慢性淋巴細胞白血病(CLL)、套細胞淋巴瘤(MCL)和瓦爾登斯特倫氏巨球蛋白血癥。Ibrutinib通過減少Y223殘基上的自磷酸化來抑制BTK。其丙烯酰胺部分與C481反應形成BTK中的共價鍵激酶結構域，它將BTK鎖定在變構抑制狀態，雖然它在治療B細胞淋巴瘤和白血病上很成功，ibrutinib會導致副作用，如出血，皮疹，腹瀉，心房顫動。為了克服副作用，科學家們設計了幾個第二代BTK抑制劑（圖5d），其中一種抑制劑，阿卡拉替尼(acalabrutinib，圖5c)，顯示效力強，口服吸收快，短半衰期以及減少與EGFR和其他Tec家族蛋白的結合。 不可逆的p90核糖體S6激酶不可逆共價抑制劑(RSKs) ? ? ? ?p90核糖體S6激酶（RSK）家族是由絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路激活的一種蛋白激酶，在黑色素瘤生長和增殖中起關鍵作用。根據RSK非共價抑制劑PP1以及蛋白共晶結構，利用計算機設計，設計合成了RSK不可逆共價抑制劑FMK，意外發現FMK對大量激酶都有作用，此外2018年Gothelf, Nissen等人設計了化合物富馬酸二甲酯，發現其是MSKs的變構共價抑制劑（圖6）。 蛋白激酶的可逆共價抑制劑 ? ? ? ?可逆共價抑制劑的結構與作用機制與不可逆共價抑制劑均相似, 而不同的是其與目標靶蛋白的共價結合是可逆的(圖7).可逆共價抑制劑的親電彈頭多為氰基、酮羰基等可逆親核加成反應受體.而其與靶標共價結合的可逆性, 使得可逆共價抑制劑的藥代動力學特征介于不可逆共價抑制劑和非共價抑制劑之間。可逆共價抑制劑在一定程度上繼承了不可逆共價抑制劑作用時間長、有效濃度低等優點, 同時也減少了脫靶帶來的毒性風險。 ? ? ? ?Taunton及其同事成功地開發了高反應性的2-氰基丙烯酸酯基RSK2可逆共價抑制劑 (圖8a)，此外也有一系列可與BTK 的Cys481發生可逆結合的共價抑制劑（圖8b） ▉ RAS家族的共價抑制劑 ? ? ? ?RAS癌基因參與人類腫瘤的發生發展，自82年Weinberg等人發現其中有活化的H-ras基因后，引起了人們對RAS癌基因在人類腫瘤發生、發展中所起作用的極大關注。經十余年研究認為，RAS癌基因參與細胞生長和分化的調控，參與多種腫瘤的形成與發展。迄今為止，對于RAS癌基因突變，還沒有有效的治療方法。然而，最近關于開發RAS蛋白的強效小共價抑制劑的報道又重新燃起了人們對這些所謂的“不可成藥”蛋白質的希望 KRAS突變體的共價抑制劑 ? ? ? ?KRAS蛋白是由 KRAS 基因編碼的一種小 GTP 酶，它屬于 RAS 超蛋白家族，是細胞生長的重要調節蛋白，一旦 KRAS 被激活后，可以激活多條信號通路，促進細胞的增殖。 ? ? ? ?KRAS 是實體瘤中最常見的癌基因之一，大約 30% 的腫瘤都存在 KRAS 突變，包括 90% 的胰腺癌，50% 的結腸癌和 25% 的肺癌。最常發生基因突變的位點是第 12、13 和 61 位密碼子，其中以 12 位密碼子的突變最為常見。最近，Shokat和同事報道了一組半胱氨酸反應抑制劑，它們與KRAS G12C突變體相互作用，隨后與G12C形成共價加合物（圖9a），此外他們篩選了其它親電試劑，例如丙烯酰胺和乙烯基磺胺，它們與G12C殘基形成不可逆的共價鍵(圖9c,e)。 ▉ 其它蛋白的共價抑制劑 乙酰膽堿酯酶的共價抑制劑 ? ? ? ?乙酰膽堿是一種刺激膽堿能的神經遞質，阿爾茲海默患者中乙酰膽堿受體降低，抑制乙酰膽堿酯酶(AChE)是目前治療阿爾茨海默氏病(AD)最有效的方法。Rivastigmine可以共價的結合在乙酰膽堿酯酶上，從共晶結構上可以看出，S203(酯位)和E202(陰離子位)與化合物有相互作用，Rivastigmine的氨基甲酰基位于活性部位的絲氨酸附近，與絲氨酸發生共價結合后釋放出一個酚類化合物（圖10）。 組織蛋白酶的共價抑制劑 ? ? ? ?組織蛋白酶是一組半胱氨酸蛋白酶，參與溶酶體的蛋白水解，并控制多種細胞信號通路。在人類中編碼有11種組織蛋白酶（B, C, F, H，K, L, O, S, V, W，和X）這些酶的過度活躍通常與疾病發展有關。 ? ? ? ?在不同的組織蛋白酶中，CatK一直備受關注。在破骨細胞中含量豐富，在骨吸收和骨重塑中起重要作用。因此，它已經成為治療骨質疏松癥的藥物靶點。與其他組織蛋白酶相比，Balicatib對CatK有很大的選擇性，但因為導致一些患者出現嗎啡樣皮膚病變因此在II期臨床研究后停用。在許多CatK的共價抑制劑，odonacatib，達到了III期試驗(圖11b)，Odonacatib含有一個丁腈基團，可與CatK to的C25發生反應形成亞氨基硫酯加合物(圖11c)。 ▉ 總結與展望 ? ? ? ?盡管在治療疾病的歷史中，共價抑制劑并不是很受歡迎，除了潛在的毒性和脫靶等缺點外，共價抑制劑發揮作用依賴于靶蛋白或者受體中的單一氨基酸殘基，如果此氨基酸發生突變，則會產生耐藥性，但共價抑制劑作用較強并且持久，可以降低給藥劑量以及給藥頻率，特別是共價抑制劑有可能作用于傳統的不可成藥的靶蛋白（例如KRAS），因此共價抑制劑將具有很好的發展前景，期待有更多的共價抑制劑上市。 ? ? ??如涉及知識產權請與我司聯系
參考文獻： 1、Lagoutte, R., Patouret, R., Winssinger, N., 2017. Covalent inhibitors: an opportunity for rational target selectivity. Current Opinion in Chemical Biology 39, 54–63. 2、Sutanto, F., Konstantinidou, M., D?mling, A., 2020. Covalent inhibitors: a rational approach to drug discovery. RSC Medicinal Chemistry 11, 876–884. 3、Ghosh, A.K., Samanta, I., Mondal, A., Liu, W.R., 2019. Covalent Inhibition in Drug Discovery. ChemMedChem 14, 889–906. |
