? ? ? ?PD-1及CTLA-4等免疫檢查點近些年來在抗腫瘤治療中進展火熱，但是在單一免疫檢查點療法中往往僅有10%到30%左右的病人病情能夠得到有效緩解，其耐藥機制仍是目前需要仔細探索的。為了突破這一瓶頸，以PD-1單抗為代表的相關免疫治療常常會與其他免疫檢查點抗體藥物聯用以求取得更顯著的治療效果。LAG3（Lymphocyte activation gene-3）是一種免疫檢查點受體蛋白，主要表達在活化的T細胞、NK細胞、B細胞、漿細胞和樹突細胞，有研究表明在一些小鼠腫瘤模型的瘤內T細胞中其PD-1表達的同時也高表達LAG3，而這類抑制分子常在調節性T細胞（Tregs）和耗竭的CD8+ T細胞上共表達，從而一定程度的抑制免疫反應的發生[1]。故與單一療法相比，LAG3與PD-1雙靶點共抑制可以有效增強CD4+及CD8+T 細胞的浸潤能力，T細胞其他功能也有所提高，這些顯著的成果使得將二者聯用的治療方法在臨床研究中成為又一熱點。 ? ? ? ?LAG3與CD4在結構上類似，含有4個胞外免疫球蛋白超家族類似結構域，這些胞外域是與配體結合是傳達T細胞抑制信號所必需的。金屬蛋白酶ADAM10/17（a disintegrin and metalloproteionase domain-containing protein 10/17）可以裂解LAG3，使其胞外端脫落形成一種單體可溶性的LAG3（sLAG3）。有研究表明，如果使得LAG3不被ADAM10/17裂解，T細胞在體外的活性被明顯抑制從而影響其在增殖及細胞因子分泌等的功能削弱[2]，但LAG3的脫落在體內對免疫相關治療的影響尚不明確。
? ? ? ?為了研究這一問題，美國匹茲堡大學醫學院的Lawrence P. Andrews團隊建立了一種T細胞表達不可裂解形式LAG3（LAG3NC）的轉基因小鼠模型，在該模型上他們進行了一系列關于LAG3脫落對抗腫瘤效果影響的實驗并于近日發表在了Science Immunology上，該文章揭示了LAG3的脫落在LAG3抑制信號通路中的重要地位，這對免疫療法的發展有積極作用。
? ? ? ?為了評估T細胞上LAG3脫落對免疫反應的影響，Lawrence P. Andrews團隊選用了Cre-loxP重組酶系統來構建轉基因小鼠模型。對LAG3序列在位于胞外結構域D4與跨膜蛋白結構域之間的Lag3 exon 7中特定區域兩端插入LoxP位點，再將表達該LAG3突變的Lag3NC.L/L小鼠與攜帶不同Cre重組酶的小鼠雜交，從而建立出在特定細胞類型上表達LAG3NC的小鼠來探究不同種類T細胞對LAG3脫落的反應，最終得到Lag3NC.L/LCD4Cre（全部T細胞表達LAG3NC）、Lag3NC.L/LE8ICre.GFP（僅CD8+細胞表達）、Lag3NC.L/LThPOKCreERT2（僅CD4+細胞表達）及Lag3NC.L/LFoxp3CreERT2.GFP（僅Tregs細胞表達）這四種類型的小鼠。
? ? ? ?研究人員分別在Lag3NC.L/L和Lag3NC.L/LCD4Cre兩種不同小鼠品系上接種MC38及B16-F10腫瘤細胞，他們發現兩個品系小鼠體內的腫瘤生長情況并無顯著不同，CD4+細胞及CD8+細胞的增殖死亡情況等也并無差異。隨后，他們使用這兩種小鼠品系進行PD-1抗體的免疫治療研究，有趣的現象發生了，Lag3NC.L/LCD4Cre小鼠對PD-1抗體的敏感性顯著降低，腫瘤清除的效果不如Lag3NC.L/L小鼠。為驗證該結論不僅局限與該腫瘤模型，Lawrence等人在這些小鼠體內建立了另外兩種不同的腫瘤模型：（1）在小鼠首次皮下接種MC38第12天切除腫瘤組織，一個月后再次接種MC38細胞評估兩種小鼠對腫瘤清除能力；（2）小鼠接種過表達gp100的B16腫瘤細胞后，選用抗PD-1藥物和Amph-vax/Amph-E7聯合給藥評估藥物的抑瘤效果。結果顯示，Lag3NC.L/LCD4Cre小鼠的抗腫瘤效果明顯較弱（圖1），這些現象均能證明T細胞上LAG3NC的表達能夠影響腫瘤的清除。
圖1. LAG3NC抑制體內的抗腫瘤作用
? ? ? ?為了進一步確定LAG3的脫落是否影響CD4+T細胞群體的功能，研究人員選用上文所提到的幾種不同的小鼠品系建立腫瘤模型并對腫瘤細胞浸潤細胞（TILs）功能性進行了檢測，LAG3胞外段的不可裂解并沒有對CD8+T細胞或Tregs細胞造成較為明顯的影響，反而是常規CD4+T細胞（Tconv細胞）的功能性（如IFN-γ，TNF-α和IL-2等細胞因子的分泌）和增殖受到了抑制（圖2）。除此之外，實驗性自身免疫腦脊髓炎（簡稱EAE，一種CD4+T 細胞介導為主的自身免疫性疾病）也作為了一種有效模型來評估LAG3NC對T細胞的影響，Lag3NC.L/LCD4Cre小鼠的EAE嚴重程度與Lag3NC.L/LE8ICre.GFP小鼠/Lag3NC.L/L小鼠相比明顯較弱。這些數據表明了受LAG3NC調控的Tconv細胞在腫瘤免疫中有著重要的地位，LAG3NC本質影響的是Tconv細胞。 圖2. LAG3NC影響T細胞功能
? ? ? ?那么CD8+T細胞呢？LAG3的脫落是否也會影響其功能呢？答案是肯定的，但這種影響并不是內在的，而是外在的。研究人員在Lag3NC.L/LE8ICre.GFP小鼠及Lag3NC.L/L小鼠上建立了腫瘤模型并對比了它們對PD-1單抗的敏感性，結果顯示二者之間并沒有明顯的藥效差異。同時，他們還對CD8+TILs的功能性進行了分析，從Lag3NC.L/LCD4Cre小鼠分離出的TILs在經過PD-1抗體治療后其CD8+T細胞的TNF-α及IFN-γ釋放能力明顯減弱，而Lag3NC.L/LE8ICre.GFP小鼠體內的CD8+ TILs功能性卻與對照組沒有大的差異（圖3），這一結果揭示了一個現象：CD8+ T細胞功能的改變或許并不是通過其細胞本身的LAG3變化，而是通過Tconv細胞上的LAG3脫落所間接影響的。
圖3. LAG3NC并非本質影響CD8+T細胞功能
? ? ? ?作者的一系列實驗證明了在小鼠體內，受到LAG3裂解本質上影響的是Tconv細胞而非CD8+T細胞或Treg細胞，進而使得T細胞相關的免疫反應受到限制，那么這一結論在臨床上是否也依然站得住腳呢？為了解決這一問題，研究人員針對LAG3與ADAM10的表達之間的關系進行了研究。通過對來自首次治療轉移性黑色素瘤病人的新鮮腫瘤組織及外周血淋巴細胞（PBLs）進行分析，他們發現與健康人的外周血淋巴細胞相比，患病者的PBLs有更多的LAG3和ADAM10表達，但二者之間的關系往往呈負相關性。為進一步確定這一規律的可靠性，他們又獲取了一些已經接受了免疫治療的晚期轉移性黑色素瘤患者及其他皮膚癌患者的樣本（包含對免疫治療有響應與無響應的）進行同樣地分析，其中無應答者的Tconv細胞LAG3表達明顯升高但ADAM10的表達減弱。這表明Tconv細胞上LAG3：ADAM10表達比例的高低可以一定程度的幫助判斷PD-1等免疫療法的成功與否。
? ? ? ?雖然這篇文章告知了我們Tconv細胞上LAG3表達對免疫療法的重要性，但與Tconv細胞相比，耗竭的CD8+T 細胞與Tregs表面的LAG3始終保持著高水平的表達[3]，難道ADAM10這些金屬蛋白酶就不能使得它們表面的LAG3脫落嗎？如果能，這些細胞上LAG3的脫落也能夠重振免疫反應嗎？怎么做能夠輔助這些LAG3的脫落？這些問題的答案尚不得知，LAG3脫落對T細胞的抑制作用的解除機制仍需進一步研究探索。目前已有多個免疫相關的臨床研究選擇與LAG3靶點藥物聯合治療，所以對LAG3抑制信號通路的理解顯得尤為重要，Lawrence P. Andrews團隊對LAG3脫落機制的發現為其相關的免疫研究提供了新的思路。相信在不久的將來隨著人們對免疫檢查點的深入研究，目前所面臨的難關必能順利地逐一突破。
Reference：
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[2]. N. Li, C. J. Workman, S. M. Martin, D. A. Vignali, Biochemical analysis of the regulatory T cell protein lymphocyte activation gene-3 (LAG-3; CD223). J. Immunol. 173, 6806–6812 (2004).
[3]. L. P. Andrews, A. E. Marciscano, C. G. Drake, D. A. Vignali, LAG3 (CD223) as a cancer immunotherapy target. Immunol. Rev. 276, 80–96 (2017).
[4]. L. P. Andrews, A. Somasundaram, J. M. Moskovitz, A. L. Szymczak-Workman, C. Liu, A. R. Cillo, H. Lin, D. P. Normolle, K. D. Moynihan, I. Taniuchi, D. J. Irvine, J. M. Kirkwood, E. J. Lipson, R. L. Ferris, T. C. Bruno, C. J. Workman, D. A. A. Vignali, Resistance to PD1 blockade in the absence of metalloprotease-mediated LAG3 shedding.? Sci. Immunol. 5, eabc2728 (2020).
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