? ? ? ?如何確定新藥人體內首次給藥（first in human，FIH）劑量是新藥研究過程中的重要環節之一，在臨床實驗的過程中，FIH劑量代表著臨床實驗的起點，因此必須絕對安全。在FDA的指導方案中，FIH可以通過在相關物種上進行的多種藥理、毒理研究得出的，“未觀察到不良反應水平”（No Observable Adverse Effect Level，NOAEL）確定，此概念一般認為是臨床前藥理毒理實驗中，在相關物種上確定的最大安全劑量。通過物種敏感度、特異性及人體適用性等相關因素可以確定NOAEL的人體等效劑量（human equivalent dose，HED），再加上特定的安全系數（safety factor）計算得出人體最大安全起始劑量（human maximum recommended safe starting dose，MRSD）。然而，能夠高度激活免疫系統的生物藥物，即使在低劑量下也可能會引起諸如細胞因子釋放綜合征、神經系統毒性等強烈的副作用。
? ? ? ?在TGN1412，CD28超級激動劑臨床實驗Ⅰ期“慘案”過后，為了提高臨床實驗的安全性，EMA和FDA在2007年發布了針對生物藥FIH確立的具體指導方針，其中強調了包括雙特異性抗體在內的一系列藥物的FIH計算，應該基于“最小預期生物效應級別”（minimum anticipated biological effect level，MABEL），此概念認為是在人體中可以被認為有生物學效果的最小劑量。
? ? ? ?近日，來自杜克大學的學者在《Journal for Immunotherapy of Cancer》上發表的文章，詳細分享了通過MABEL方法計算他們設計的一種用于治療膠質母細胞瘤的EGFRvⅢ-CD3雙特異性抗體（EGFRvⅢ-CD3 bi-scFv）MRSD的方法，同時驗證了通過此方法計算得出的FIH劑量在人外周血CD3的理論受體占有率（Theoretical receptor occupancy），來確定這一FIH劑量的安全性。
? ? ? ?在本文中，MABEL的計算應用了體外、體內藥代動力學/藥效學（PK/PD）的數據，包括：在人類與相關物種體內靶細胞上的靶標結合及受體占有率；人類與相關物種靶細胞上的濃度-反應（concentration-response）曲線；相關物種體內的劑量/暴露-反應（dose/exposure-response）曲線等。
EGFRvⅢ-CD3 bi-scFv與血細胞的結合
? ? ? ?研究者使用了流式細胞法，分別檢測了EGFRvⅢ-CD3 bi-scFv雙特異性抗體與人、比格犬、CD-1小鼠、食蟹猴、Sprague Dawley大鼠、新西蘭白兔和豬的外周血單個核細胞（PBMC）的結合能力，來評估EGFRvⅢ-CD3 bi-scFv在細胞水平上與CD3ε的親和力。實驗結果顯示（圖1），EGFRvⅢ-CD3 bi-scFv只與人的PBMC結合，與其他種類動物的PBMC不結合。與人PBMC結合的EC20為150ng/mL。
圖1 流式細胞法檢測，在人及相關物種（食蟹猴、比格犬、小鼠、新西蘭白兔、大鼠）的PBMC中，EGFRvⅢ-CD3 bi-scFv 只與人的PBMC結合，且EC20為150ng/mL
EGFRvⅢ-CD3 bi-scFv與腫瘤細胞的結合
? ? ? ?使用流式細胞法，分別檢測了EGFRvⅢ-CD3 bi-scFv與野生型人膠質瘤細胞系U87-MG（不表達EGFRvⅢ）及U87-MG-EGFRvⅢ穩轉腫瘤細胞系（表達EGFRvⅢ）的結合，用以評估EGFRvⅢ-CD3 bi-scFv與EGFRvⅢ在細胞水平上的結合能力。結果如圖2，EGFRvⅢ-CD3 bi-scFv與U87-MG-EGFRvⅢ穩轉腫瘤細胞系結合的EC20 為10307 ng/mL，與野生型U87-MG細胞系基本無結合。
圖2流式細胞法檢測，EGFRvⅢ-CD3 bi-scFv與EGFRvⅢ高表達腫瘤細胞系結合的EC20 為10307 ng/mL
細胞因子釋放實驗
? ? ? ?使用Luminex multiplex platform，分別在PBMC單獨存在、PBMC+ U87-MG-EGFRvⅢ細胞（EGFRvⅢ+）、PBMC+ U87-MG細胞（EGFRvⅢ-）條件下，對hEGFRvIII-CD3 bi-scFv介導的人PBMC細胞因子釋放進行了檢測，使用PMA作為陽性對照。結果顯示（圖3），hEGFRvIII-CD3 bi-scFv介導人CD3+的細胞產生細胞因子的釋放量具有腫瘤抗原依賴性和劑量依賴性，在無EGFRvⅢ抗原存在的情況下，EGFRvIII-CD3 bi-scFv無法誘導細胞因子釋放；在有EGFRvⅢ存在的情況下，EGFRvIII-CD3 bi-scFv誘導人PBMC細胞因子IFN-?、IL-6、MIP-1α、GM-CSF和TNFα釋放的EC20分別為42.3、12.5、14.7、27.6和16.5 ng/mL。
圖3 hEGFRvIII-CD3 bi-scFv介導的人PBMC細胞因子釋放呈抗原依賴效應及劑量依賴效應
T細胞激活和增殖實驗
? ? ? ?將EGFRvIII-CD3 bi-scFv在存在腫瘤抗原（U87-MG-EGFRvⅢ）或不存在腫瘤抗原（U87-MG）的條件下與人PBMC共同孵育5天，分別通過檢測CD25+T細胞的表達量和CFSE標記細胞的比例來評估EGFRvIII-CD3 bi-scFv激活T細胞及誘導T細胞增殖的能力。結果顯示，EGFRvIII-CD3 bi-scFv介導的T細胞激活及T細胞增殖具有抗原特異性和劑量依賴效應。在EGFRvⅢ存在的體系中，EGFRvIII-CD3 bi-scFv激活T細胞和介導T細胞增殖的EC20分別為1021ng/mL、70.2 ng/mL。
圖4 EGFRvIII-CD3 bi-scFv在EGFRvIII+體系中介導T細胞激活的EC20為1021ng/mL為，介導T細胞增殖的EC20為70.2 ng/mL
腫瘤細胞殺傷實驗
? ? ? ?使用鉻釋放測定法，分別檢測了EGFRvIII-CD3 bi-scFv對U87-MG-EGFRvⅢ細胞和U87細胞的殺傷效果，效靶比為20:1。結果顯示，EGFRvIII-CD3 bi-scFv對U87-MG-EGFRvⅢ細胞的殺傷效果具有劑量依賴效應，EC20為1.34 ng/mL；對U87野生型細胞幾乎無殺傷作用。
圖5 EGFRvIII-CD3 bi-scFv對腫瘤細胞的殺傷效果具有腫瘤抗原特異性
? ? ? ?以上全部體外實驗結果匯總如表1所示，按照每種體外實驗的20%藥理活性濃度（20% of the maximal effective concentration，EC20），基于人平均血漿容積為3L、患者平均體重為70kg計算人體初始給藥劑量（MRSD）。本系列實驗中，最低的EC20來自于腫瘤細胞毒性實驗（1.34 ng/mL），相當于每位患者4020 ng或 57.4 ng/kg的起始劑量。
表1 體外實驗測定的EC20值及對應的HED值
小鼠體內重復給藥、單次給藥毒性實驗
? ? ? ?研究人員分別在NSG-人PBMC免疫重建小鼠模型和CD3人源化小鼠模型上進行了體內毒性實驗。在移植了U87-MG-EGFRvⅢ膠質瘤細胞和人PBMC的NSG免疫缺陷小鼠中，EGFRvIII-CD3 bi-scFv的給藥劑量為2.5 mg/kg，經尾靜脈連續給藥5天，每日一次。結果顯示，給藥組的小鼠生存率較溶劑對照組有顯著性延長（圖6，P=0.0079），證明EGFRvIII-CD3 bi-scFv在此模型上不具有毒性。
? ? ? ?在CD3人源化小鼠模型中，研究人員也測試了EGFRvIII-CD3 bi-scFv單次給藥10 mg/kg的劑量，同樣未觀察到顯著的毒性反應（數據未給出）。此數據結合該實驗室往次實驗結果表明，在嚙齒動物模型上，每日2.5 mg/kg的給藥劑量為安全有效劑量。
圖6 EGFRvIII-CD3 bi-scFv在U87-MG-EGFRvⅢ/PBMC-NSG鼠移植模型上可顯著提高小鼠生存率
體內有效、安全劑量計算
? ? ? ?基于嚙齒類模型中每日2.5 mg/kg的安全有效給藥劑量，計算人體等效劑量。公式為
CLhu：預期人體清除率；Ceff,ss：預測穩態下有效濃度；Tau：給藥間隔
? ? ? ?hEGFRvIII-CD3 bi-scFv的結構與博納吐單抗（Blinatumomab，Blincyto，CD3-CD19雙特異性抗體，2014年美國上市）類似，博納吐單抗在成年人體內的清楚速率為43 mL/h/kg，因此研究者選用這個數據作為CLhu的參考。Ceff,ss為在hCD3轉基因小鼠中以5 mg/kg劑量測得的PK數據（0.583 μg/mL）。給藥間隔Tau為24小時。
? ? ? ?根據此公式，計算出的人體等效劑量為0.6mg/kg，而由體外實驗數據計算得出的MABEL劑量為57.4ng/kg，較嚙齒類動物模型上藥效數據計算出的劑量低10400倍。證實了此劑量（57.4ng/kg）在動物模型上的安全性。
受體占有率計算
? ? ? ?靶抗原的理論占有率（receptor occupancy，RO）是藥物臨床起始劑量選擇的重要因素之一。TGN1412 FIH的選擇，0.1mg/kg的劑量換算得出的人體外周血中的RO約為90%，對于激動劑而言可能過高。在本文中，研究人員根據兩個不同的公式評估了基于MABEL方法計算得出的hEGFRvIII-CD3 bi-scFv給藥劑量（57.4ng/kg）在人體中的理論受體占有率，如下所示：
? ? ? ?公式1：
? ? ? ?公式1基于米氏方程（Michaelis-Menten equilibrium），其中RO為受體占有率，Ab為抗體起始濃度（引用細胞毒性實驗EC20，1.34 ng/mL或26.3pM），KD為藥物對應抗原的平衡解離常數。
? ? ? ?公式2：
? ? ? ?公式2為公式1的升級版，由于在已知體系中存在大量靶受體的情況下，由米氏方程計算出的RO可能不準確，因此選用公式2進行RO的計算。其中RO為受體占有率，KD為藥物對應抗原的平衡解離常數，TD為總藥物濃度（對應細胞毒性實驗EC20，1.34 ng/mL或26.3pM），TT為總目標濃度。
? ? ? ?TT的計算方法為：
? ? ? ?其中n1為每個細胞上CD3受體的數目（6.11×104），n2為每體積中T細胞的數目（1.3×109 L?1），NA為阿伏伽德羅常數。
? ? ? ?由公式2計算得出的MABEL劑量的理論受體占有率（引用與CD3ε結合的KD和細胞毒性實驗的EC20）為0.17%。對于激動劑而言，根據已知藥理學和臨床前實驗的經驗，可接受的RO數據上限約為10%，本研究中基于MABEL劑量計算得出的RO的數據遠低于這一限度。但研究人員也說明了這種方法的限制性，由于hEGFRvIII-CD3 bi-scFv為雙特異性抗體，該方法無法計算藥物同時與表達于不同細胞上的靶抗原（EGFRvIII于腫瘤細胞，CD3于T細胞）結合的理論受體占有率。
? ? ? ?本文詳細地介紹了一種激動劑型雙特異性抗體基于MABEL方法計算FIH的過程及實驗思路，通過對比MABEL劑量與臨床前體內等效劑量，確定了這種方法的安全性，對于激動型抗體藥物的FIH計算具有一定的參考價值。
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參考文獻
Schaller, Teilo H., et al. "First in human dose calculation of a single-chain bispecific antibody targeting glioma using the MABEL approach." Journal for Immunotherapy of Cancer 8.1 (2020).
