? ? ? ?血腦屏障是位于血液和腦脊液、血液和腦細胞之間，由腦毛細血管壁、內皮細胞和神經膠質細胞等形成的天然屏障。由于血腦屏障主要由內皮細胞間緊密連接形成，大多數大分子物質（包括蛋白類藥物）無法穿越，因此這類物質進入中樞神經系統（central nervous system，CNS）的效率受到嚴重限制。傳統的針對CNS的給藥方式，包括顱內給藥、鞘內給藥、腦室內給藥和化學破壞血腦屏障給藥等，具有侵入性，可能對腦組織造成損傷，不利于重復給藥。腦組織暴露不足和給藥方式的限制，使許多針對CNS的抗體藥物無法發揮應有的藥效。 ? ? ? ?近日，來自Denali Therapeutics Inc.的科學家在《Science Translational Medicine》上介紹了他們設計的雙特異性抗體，稱之為血腦屏障運輸工具抗體（antibody transport vehicle，ATV）。這種抗體被認為可特異性地與大腦內皮細胞表面上表達的RMT受體結合，利用受體介導的胞吞效應（receptor-mediated transcytosis，RMT）穿過血腦屏障，極大地提高抗體藥物向中樞神經系統的傳遞效率。
ATV靶點的選擇 ? ? ? ?這項研究中選擇了轉鐵蛋白受體（transferrin receptor，TfR）作為穿越血腦屏障的靶點。TfR在腦內皮細胞上高度表達，是重要的配體非依賴性胞吞的受體，早期動物模型實驗結果顯示，與TfR單價結合的低親和力的抗體可以提高大腦對藥物的攝取能力。大腦和腦脊液中的β淀粉樣蛋白（β-secretase 1，BACE1）可作為阿爾茲海默癥的生物標志物，前期數據表明抗BACE1抗體可減少小鼠大腦中β淀粉樣蛋白的含量，因此研究人員選擇了BACE1作為ATV的治療靶點。 ATV的構建和親和力改造 ? ? ? ?研究人員在人IgG1的Fc端選取了一段既遠離FcRn和Fc?R結合位點又適合作為新的抗原結合位點的9個氨基酸組成的序列（圖1A）。對這個序列進行隨機化重組，然后利用酵母展示技術和流式細胞分選技術，篩選出了四個與hTfR胞外段結合的Fc蛋白（圖1B）。將這四個Fc蛋白與抗BACE1的Fab融合構建出ATV:BACE1重組抗體。這些ATV:BACE1抗體在蛋白水平（圖1C，ELISA）和細胞水平（圖1D，免疫熒光染色）都能與hTfR結合。最后在這四個重組抗體的基礎上，通過文庫篩選獲得了親和力較高且能與食蟹猴TfR（cTfR）結合的一系列ATV:BACE1抗體（圖2）用于后續體內外功能驗證。 圖1，A野生型Fc同源二聚體蛋白結構模型，橙色部位為篩選的9個氨基酸所處位置；B，篩選得出的4個Fc序列（TV）；C，ATV:BACE1重組抗體與hTfR蛋白的結合能力；D，ATVc:BACE1與HEK293細胞（表達TfR，不表達BACE1）的結合能力。 圖2：不同ATV:BACE1克隆對人TfR、食蟹猴TfR的親和力。 ATV:BACE1在細胞水平上的內化 ? ? ? ?研究人員使用knob-in-hole技術合成了Fc上具有TfR單個結合位點的ATV:BACE1異源二聚體（圖3A）。將ATV:BACE1異源二聚體與HEK293細胞（表達TfR）或CHO細胞（不表達TfR）在37℃共孵育30 min后，使用抗人IgG熒光染料染色，觀察到HEK293細胞內化的熒光標記數與ATV:BACE1濃度呈劑量依賴效應（圖3B），而與ATV:BACE1共孵育的CHO細胞及與Anti-BACE1共孵育的HEK293細胞均無熒光標記（圖3B）。通過對內化的TfR熒光染色，顯示約有50%的ATV:BACE1與TfR定位在細胞內相同的位置。這些結果表明ATV:BACE1在細胞上的內化依賴于TfR，且ATV:BACE1與TfR的結合不影響TfR的內化。 圖3：A，knob-in-hole型ATV:BACE1異源二聚體的結構；B，HEK293及CHO細胞中ATV:BACE1的染色；C，HEK293細胞中anti-BACE1的染色；D，HEK293細胞中ATV:BACE1與TfR的共染色。 雙特異性ATV在細胞水平上的療效 ? ? ? ?為了使ATV發揮更好的神經退行性疾病療效，研究人員將針對兩個直接與阿爾茲海默癥形成有關靶點（β-secretase、Tau蛋白）的片段與ATV融合，制備了ATV:BACE1/Tau雙特異性抗體（圖4A），這種雙特異性抗體可以同時與BACE1、Tau、hTfR三個靶點結合（圖4B）。與同型對照IgG和anti-Tau抗體相比，ATV:BACE1/Tau雙特異性抗體減少了50%人初級皮質神經元細胞中Aβ-secretase 40的數量（圖4C）。熒光共振能量轉移（fluorescence resonance energy transfer，FRET）的實驗結果顯示，預先接種Tau蛋白的HEK293細胞經ATV:BACE1/Tau處理后能有效降低細胞中Tau蛋白的聚集（圖4D）。這些結果表明ATV:BACE1/Tau在細胞水平上具有良好的生物治療活性。 圖4：A，ATV:BACE1/Tau雙特異性抗體的結構；B，ATV:BACE1/Tau與BACE1、Tau、hTfR結合的生物干涉結果；C，ATV:BACE1/Tau處理后人神經細胞中Aβ40的含量；D，顯ATV:BACE1/Tau處理后預先接種Tau蛋白的HEK293細胞中Tau蛋白的聚集情況（熒光共振能量轉移）。 ATV:BACE1在嚙齒類及非人靈長類動物模型上的療效 ? ? ? ?TfRmu/hu轉基因小鼠和食蟹猴模型中，ATV:BACE1表現出與親和力正相關的藥代動力學數據與生物清除效率（圖5C，D，圖6A）。TfRmu/hu轉基因小鼠單次給藥24小時后（50mg/kg），與anti-BACE1治療組小鼠相比，ATV:BACE1治療組小鼠增加了40倍的藥物腦部暴露率（圖5A），同時可減少57%腦部可溶性Aβ40的含量（圖5B）。共聚焦顯微鏡下大腦皮層染色結果進一步表明ATV:BACE1給藥組小鼠大腦神經細胞中有顯著的藥物吸收（圖5G，H）。單次給藥后，腦部藥物暴露率的增強可持續7天以上，持續維持腦部較低水平可溶性Aβ40含量（圖5E，F）。食蟹猴模型實驗結果顯示，在靜脈單次給藥（30 mg/kg）48h后，ATV:BACE1治療組食蟹猴在尾狀核、小腦、腦皮層、海馬區、丘腦等腦區ATV:BACE1治療組藥物濃度較control IgG對照組及anti-BACE1組均有顯著增加（圖6C），且這些區域內可溶性淀粉樣前體蛋白β的含量減少了32%-69%（圖6D）。以上實驗結果在動物模型上證明了ATV:BACE1具有良好的穿越血腦屏障能力，以及治療阿爾茲海默癥等神經退行性疾病的潛在效果。 圖5：A，TfRmu/hu轉基因小鼠單次給藥24h后腦部hIgG的濃度；B，TfRmu/hu轉基因小鼠單次給藥24h后腦部Aβ40的數量；C，TfRmu/hu轉基因小鼠血清中藥物PK數據（0-7天）；D，TfRmu/hu轉基因小鼠腦部藥物PK數據（0-7天）；G、H，共聚焦顯微鏡TfRmu/hu轉基因小鼠神經免疫熒光染色結果。 圖6：A，ATV:BACE1在食蟹猴血清中PK數據；B，ATV:BACE1治療后Aβ40在食蟹猴血漿中PD數據；C，ATV:BACE1在食蟹猴尾狀核、小腦、腦皮層、海馬區、丘腦等腦區的濃度；D，ATV:BACE1治療后食蟹猴尾狀核、小腦、腦皮層、海馬區、丘腦等腦區APPβ的含量。 ? ? ? ?盡管過去30年間抗體藥物已在癌癥以及自身免疫疾病治療領域發揮至關重要的作用，在神經退行性疾病治療上的應用卻止步不前。如何增強抗體藥物腦部的吸收效率是該領域的痛點。該文通過構建具有RMT受體結合位點的雙特異性抗體為增強抗體藥物腦部暴露率提供了新思路，相信未來這一理念有望解決神經退行性疾病治療的難題。 ? ? ? ?原創內容未經授權，禁止轉載至其他平臺。
參考文獻 Kariolis, M. S., Wells, R. C., Getz, J. A., Kwan, W., Mahon, C. S., Tong, R., ... & Assimon, V. A. (2020). Brain delivery of therapeutic proteins using an Fc fragment blood-brain barrier transport vehicle in mice and monkeys. Science Translational Medicine, 12(545). |
